#Pequenos dispositivos agilizam diagnóstico à beira do leito

Postado em

Ricki Lewis

Dois pequenos dispositivos para serem usados à beira do leito, que identificam rapidamente a susceptibilidade antimicrobiana e avaliam o risco de sepse, apresentam resultados experimentais promissores em amostras clínicas, de acordo com duas publicações recentes.

Um dos dois dispositivos com uso baseado em microfluídica instala um ensaio colorimétrico clássico para detectar a respiração bacteriana em uma amostra de urina na presença de antibióticos selecionados. O outro detecta um biomarcador no sangue que sinaliza sepse iminente.

Os dispositivos podem acelerar o diagnóstico de infecção bacteriana grave, o que é uma necessidade atraente por dois motivos, de acordo com o Dr. Steven Waldern, diretor da American Academy of Family Physicians ‘Alliance for eHealth Innovation.

“Um dos motivos é usar antibióticos de amplo espectro que não são eficazes, atrasando o tratamento. O outro é a epidemia crescente de resistência aos antibióticos. Qualquer dispositivo que permita individualizar a partir de um conjunto de antibióticos aos quais as bactérias são susceptíveis, e não expor as bactérias a outros antibióticos, ajuda a limitar a resistência antibiótica”.

Susceptibilidade a antibióticos

Jonathan Avesar, candidato a doutorado no Technion-Israel Institute of Technology em Haifa (Israel), e colaboradores, desenvolveram um sistema de “matriz estacionária de nanolitros de gotículas” para fornecer exames de susceptibilidade antimicrobiana (SNDA-AST), que descreveram em um artigo publicado on-line em 18 de julho em Proceedings of the National Academy of Sciences. A análise e a multiplexação automatizada dos dados permitem que o sistema forneça resultados dentro de um dia útil, reduzindo o tempo de diagnóstico para a infecção do trato urinário em dois ou mais dias.

O dispositivo SNDA-AST se encaixa em uma lâmina padrão de microscópio. Ele analisa a viabilidade bacteriana (respiração), utilizando a resazurina, um indicador fluorescente usado desde 1929, que é mais sensível do que as leituras baseadas em turbidez comumente usadas. As 200 cavidades da matriz contêm um único tipo de antibiótico liofilizado. Uma vez que bactérias suscetíveis em uma amostra de urina reduzem a resazurina para resorufina, a cor do ensaio muda de azul para vermelho. O grau de fluorescência, avaliado a cada meia hora, é proporcional à densidade bacteriana.

No estudo atual, os pesquisadores testaram 12 combinações de bactérias/antibióticos, usando amostras de urina fresca, comparando os resultados do SNDA-AST com o sistema de ensaio líquido automatizado já aprovado, chamado VITEK 2 AST. As amostras foram inicialmente passadas através de um filtro maior para remover leucócitos e detritos grandes e, em seguida, introduzidas em cada um dos sistemas de ensaio. Cavidades sem antibióticos serviram como controles.

O tempo necessário para detectar a suscetibilidade foi significativamente mais curto com o SNDA-AST, de cinco horas para Escherichia coli exposta à ampicilina, e quatro horas para as bactérias expostas à ciprofloxacina, por exemplo. Em comparação, o ensaio VITEK 2 AST levou 9,75 horas para os mesmos testes. Dois falsos-negativos resultaram de bactérias em fase de latência, possivelmente devido à refrigeração de amostras de urina.

A pesquisadora principal Shulamit Levenberg, citou os benefícios do dispositivo: “testar um pequeno número de bactérias colhidas diretamente de amostras dos pacientes, reduzindo as etapas para cultura e preparação da amostra; menor uso de reagente; simplicidade de operação usando uma pipeta; e dispersão da amostra em centenas de volumes menores, que podem capturar mais heterogeneidade bacteriana do que medidas em massa, enquanto colocam em quarentena bactérias contaminantes”. A dispersão da amostra acelera o ensaio, aumentando a relação superfície/volume, o que melhora o fornecimento de oxigênio para as câmaras de cultura. O SNDA-AST custaria de 1 a 2 dólares para um painel com 10 antibióticos, acrescentou ela.

“Um exame à beira do leito que nos ajudasse a entender o micro-organismo e a susceptibilidade aos antibióticos revolucionaria o tratamento”, disse o Dr. David Liebers, diretor médico do Ellis Hospital em Schenectady, Nova York, ao Medscape.

Estratificação da sepse

A sepse grave custa 24 bilhões de dólares ao ano, afetando mais de um milhão de pacientes, um quinto dos quais requerendo cuidados na unidade de terapia intensiva. A taxa de mortalidade permanece alta, de 28% a 50%. Além disso, a sobrevida em 72 horas cai para 7,7% por hora de atraso no tratamento efetivo.

O protocolo diagnóstico atual (“critério de síndrome de resposta inflamatória sistêmica, SIRS”) para sepse monitora temperatura, frequência respiratória, pressão parcial de CO2 e contagem diferencial de leucócitos. Identificar espécies bacterianas leva de um a três dias para cultura, além de tempo para análise do ácido nucleico.

O antígeno de grupamento de diferenciação de neutrófilos 64 (CD64), um biomarcador de sepse, pode se somar à SIRS. O número de moléculas de CD64 aumenta sete vezes em neutrófilos durante a infecção; elas são encontradas normalmente em monócitos.

Umer Hassan, um pesquisador associado de pós-doutorado na University of Illinois em Urbana-Champaign, e colaboradores, incorporaram o exame de CD64 em um pequeno “biochip” microfluídico que aplica “tecnologia de captura de imunoafinidade diferencial” para identificar rapidamente pacientes com risco elevado de sepse. Eles descrevem o dispositivo em um artigo publicado on-line em 3 de julho na Nature Communications.

À medida que uma amostra de sangue de 10 µL entra no biochip, ácido fórmico e saponina promovem lise dos glóbulos vermelhos. Os sensores elétricos contam então as células remanescentes e, em uma câmara de captura de células, anticorpos fluorescentes anti-CD64 se ligam às células com antígenos. Finalmente, um segundo contador elétrico contabiliza as células às quais os anticorpos não se ligaram e, quando subtraído da contagem total de células, produz o nível de expressão de CD64.

“O biochip descartável para cada teste é do tamanho de um cartão de crédito. Seu leitor associado, os sistemas eletrônico e fluídico podem ser do tamanho de uma torradeira”, disse Hassan. O cartucho comercial final, que fornece contagem de células e níveis de CD64, custará de 10 a 20 dólares, e fornece resultados em menos de 30 minutos.

Os pesquisadores testaram o dispositivo em 450 amostras de pacientes do Carle Foundation Hospital, em Urbana, Illinois, cujos profissionais responsáveis haviam pedido exame de sangue na admissão ou tinham quadro de SIRS. Entre 68 pacientes que sobreviveram à sepse, os pesquisadores descobriram que a contagem de células CD64+ deles aumentou e em seguida diminuiu durante a internação hospitalar. No entanto, entre seis pacientes, e nenhum deles sobreviveu, a contagem de CD64+ continuou a subir até o óbito.

As contagens de células do dispositivo microfluídico concordaram com as de análise de hematologia e citometria de fluxo, tecnologias que o dispositivo poderia substituir.

“O biochip precisa ser testado em estudos clínicos multicêntricos em diferentes populações de pacientes. Prevemos completar esta fase nos próximos 1 a 2 anos”, disse Hassan ao Medscape.

O estudo atual não foi cegado ou randomizado, mas a população era realista, observam os autores.

O ensaio de sensibilidade aos antibióticos e o biochip de sepse podem ser complementares, diz Hassan, “Nosso exame à beira do leito é focado no diagnóstico de sepse pela avaliação da resposta imune do paciente à infecção patogênica. No entanto, determinar a susceptibilidade antimicrobiana à beira do leito também é fundamental para fornecer tratamento antibiótico adaptado aos pacientes. Portanto, nosso teste pode ser usado para o diagnóstico, e o teste de susceptibilidade pode ser usado para o tratamento da sepse”.

Os dois dispositivos são adaptáveis e expansíveis, melhorando a precisão do diagnóstico. O SNDA-AST pode acomodar diversos antibióticos, e o biochip de sepse pode incluir vários antígenos.

Hassan e dois coautores têm relações financeiras com Prenosis, Inc. Os outros pesquisadores e o comentarista declararam não possuir conflitos de interesses relevantes.

Nature Comm. Publicado on-line em 3 de julho de 2017. Resumo

Proc Natl Acad Sci USA. Publicado on-line em 18 de julho de 2017. Resumo

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